За несколько столетий дафнии адаптировались к колебаниям концентрации ф

Dmitri Kabanov написал(а) к All в Dec 19 17:09:46 по местному времени:

За несколько столетий дафнии адаптировались к колебаниям концентрации фосфора в озере.

В одном из озер Миннесоты ученые нашли яйца дафний, которые были отложены более 600 лет назад и с тех пор покоились в донном осадке. Оказалось, что в благоприятных условиях из них вылупляются вполне жизнеспособные дафнии. Это позволило сравнить фенотипы, ДНК и РНК "пришельцев" из прошлого и современных рачков, которые честно эволюционировали всё это время. За последние 120 лет из-за использования фосфорных удобрений на прибрежных фермах в озере сильно повысилась концентрация фосфора. Выяснилось, что около 1000 генов, уровень экспрессии которых у "пришельцев" был относительно постоянным, у современных дафний стали работать более гибко, обеспечивая адаптацию к изменениям концентрации фосфора в среде. На уровне фенотипа это приводит к расширению нормы реакции по интенсивности поглощения фосфора, и одновременно к более стабильным скорости роста и гомеостазу фосфора в соматических тканях.

Эволюционные исследования особенно зависимы от наличия хороших исследовательских объектов. В основе эволюции лежат мутации и отбор. Мутации - это не слишком частые события, а уж полезные мутации - и подавно. Значит, чтобы увидеть эволюционный процесс воочию, нужны такие организмы, которые можно изучать в большом количестве и на протяжении многих поколений. Поэтому лучше всего подходят маленькие существа с коротким жизненным циклом.

Часто ученые экспериментируют с бактериями, дрожжами или вирусами, жизненный цикл которых составляет менее суток. Но, откровенно говоря, удовлетвориться только такими простыми объектами не получается - нужно исследовать и более сложных (и располагающихся ближе к нам на древе жизни) многоклеточных животных. Можно, к примеру, взять мух, мелких червей или рыбок, жизненный цикл которых занимает от двух до нескольких недель. За реалистичный для исследования срок в несколько лет можно пронаблюдать смену нескольких десятков поколений таких животных. Это, вроде, не так уж мало, но и не много, а в масштабе реальной эволюционной истории - практически ничего.

Есть и другой путь. Можно делать выводы о прошлом, сравнивая между собой современные виды. Специальные методы позволяют из таких сравнений "выводить" фенотипы и генотипы общих предков. В большинстве случаев это единственная возможность узнать хоть что-нибудь о предковых организмах, которые жили сотни лет назад или ранее (не считая, конечно, палеонтологии, которая, однако, предоставляет только выборочную информацию об анатомии организмов из прошлого).

Но вот нашелся прямо таки идеальный объект для эволюционного биолога - им оказались дафнии. У этих вездесущих мелких планктонных ракообразных очень пластичная стратегия размножения. При благоприятных условиях (в течение лета, когда тепло и сытно) они размножаются бесполым путем (партеногенезом). Цикл смены поколений при этом занимает всего около 10 дней, а из всех яиц снова и снова появляются самки (потомство появляется в результате яйцеживорождения; как это происходит, можно посмотреть, например, в этом видео). При неблагоприятных условиях из некоторых яиц появляются самцы и дафнии переходят к половому размножению. После оплодотворения самки производят яйца, которые переходят в стадию покоя, и могут храниться в таком виде в донном осадке, не теряя жизнеспособности на протяжении длительного времени - как выяснилось, вплоть до сотен лет.

Покоящиеся яйца можно без особого труда извлечь из осадка и "реанимировать". Это позволяет, фактически, работать с генотипами и фенотипами животных, существовавших в разное время и при разных условиях среды. Такой подход, получивший название "экспериментальная палеолимнология", был впервые предложен в 1999 году (W. C. Kerfoot et al., 1999. A new approach to historical reconstruction: Combining descriptive and experimental paleolimnology).

Этой возможностью и воспользовались ученые из США, авторы целой серии исследований на "реанимированных" дафниях. Работа была начата в 2010 году, а первые публикации по ее результатам вышли в 2014 году и с тех пор появляются ежегодно (D. Frisch et al., 2014. A millennial‐scale chronicle of evolutionary responses to cultural eutrophication in Daphnia, P. R. Chowdhury et al., 2015. Differential transcriptomic responses of ancient and modern Daphnia genotypes to phosphorus supply, R. E. Sherman et al., 2017. Genotype-specific relationships among phosphorus use, growth and abundance in Daphnia pulicaria, A. M. Yousey et al., 2018. Resurrected ‘ancient’ Daphnia genotypes show reduced thermal stress tolerance compared to modern descendants).

Очередная статья вышла 14 ноября нынешнего года в журнале Molecular Biology and Evolution. О ней мы и расскажем.

Исследование проводилось на Южном Центральном озере в округе Чисаго, штат Миннесота. Известно, что в течение последних 120 лет озеро подвергалось загрязнению фосфорными удобрениями, которые начали активно использовать на полях с конца XIX века при модернизации сельского хозяйства. Как мы теперь знаем, такое загрязнение, возникающее из-за естественного смыва удобрений в водоемы, оказывает сильное влияние на экологические сообщества. Избыток фосфора приводит к интенсивному "цветению" воды (нарастанию массы одноклеточных водорослей) и эвтрофикации водоема - увеличению общей биопродуктивности. К сожалению, итогом в большинстве случаев становится обеднение воды кислородом и массовый мор крупных животных (например, рыб), населяющих водоемы. Все это побуждает активно изучать подобные биотопы, чтобы лучше прогнозировать влияние человеческой деятельности на природные экосистемы и вырабатывать рациональные контрмеры.

Итак, ученые решили исследовать изменения, которые произошли в фенотипах и генотипах дафний из вышеназванного озера за последние сотни лет. Было взято несколько образцов донных осадков в виде колонок (кернов) глубиной до 96 см. Колонки разделили на слои по сантиметру толщиной и каждый слой датировали, используя радиометрический метод, - чтобы примерно оценить возраст дафний из каждого слоя.

Как оживить дафнию?

Керны донного осадка забирают при помощи специальных пластиковых трубок диаметром около 15 см. Полученные колонки последовательно нарезают на слои толщиной по 1 см, раскладывая образцы по отдельным пакетам, на которых подписана глубина соответствующего слоя. Эти пакеты затем хранятся в холоде, пока до них не дойдет черед.

Немного материала (около 5 г) из каждого слоя отправляется на радиометрическое датирование, а все остальное промывают и просеивают. Покоящиеся яйца дафний упакованы в эфиппиумы (сброшенные раковинки материнской особи), размер которых - чуть менее 1 мм. Чтобы их отделить, образец сначала пропускают через сито с более крупными ячейками (так убирается все, что больше необходимого размера), а затем - через более мелкое сито (чтобы смыть пыль).

Исследователь отбирает эфиппиумы, высвобождает из них яйца, переносит их в жидкость с питательным субстратом и помещает посуду с яйцами в инкубатор с оптимальной температурой (20°C). Развитие эмбриона в таких условиях занимает от 48 часов до нескольких недель. По завершении развития из яйцевых оболочек высвобождаются дафнии (самки), которые, спустя 5-7 дней начинают производить партеногенетические яйца.

https://youtu.be/ek6G-nD6niY

Для датирования донных осадков используют 210Pb. Этот изотоп свинца является продуктом распада радионуклида 222Rn (радон), представляющего собой при нормальных условиях инертный газ. Радон, в свою очередь, - продукт распада радиоизотопов радия, урана и тория, входящих в состав некоторых минералов литосферы. Он регулярно поступает в атмосферу, выносясь на поверхность грунтовыми водами, где быстро (период его полураспада - несколько дней) распадается до дочерних изотопов: 210Pb и 210Po. В итоге содержание 210Pb в атмосфере относительно постоянно. С пылевыми частицами 210Pb попадает в озерную воду, далее - в донный осадок, а после того, как система замыкается (закрывается новыми толщами осадка сверху), содержание 210Pb начинает падать, поскольку из атмосферы атомы уже не попадают, а те, что попали изначально, постепенно распадаются с образованием дочерних атомов. Период полураспада 210Pb составляет 22,3 года, так что метод лучше всего работает для осадков возрастом от 5 до 160 лет.

Чтобы верифицировать датировки, полученные по изотопу свинца, ученые также использовали измерения радиоизотопа 137Cs (цезий). В 1950-1960 годах в атмосферу поступило большое количество этого радионуклида из-за испытаний ядерного оружия. Потом он постепенно оседал, что хорошо заметно в виде пика этого изотопа в слое, отложенном в 1960-1970 годах.

А вот для уточнения датировок более глубоких и древних слоев хорошо подошел бы радиоуглеродный метод, основанный на измерении радиоизотопа 14С: он лучше работает с образцами старше 500 лет. Однако в обсуждаемой работе радиоуглеродный анализ, к сожалению, не проводился.

В изученных образцах донных осадков 160-летний слой (датированный 1855 годом) залегал на глубине 46 см, а возраст всех нижележащих слоев был оценен в предположении о приблизительно постоянной скорости осадконакопления относительно двух самых нижних радиометрически датированных слоев. Само собой, точность таких оценок заметно ниже.

Химический анализ слоев выявил, что за последние 120 лет концентрация фосфора в осадках выросла в 2,4 раза. Одновременно повышалось и содержание органического углерода - признак эвтрофикации. Эти изменения шли нога об ногу с ростом населения в округе (рис. 2, левый график).

В 2010 году, когда начиналось это большое исследование, было получено 4 реанимированных популяции: две "древних" (яйца были извлечены из слоев, датированных 1418 и 1646 годами) и две "современных" (яйца 1977 и 2007 годов). На рис. 2 они обозначены красными треугольниками. Эти рачки были всесторонне изучены: оценивалось несколько признаков фенотипа, также были исследованы образцы их ДНК и РНК.

Целью нынешнего исследования было сопоставить фенотипы рачков разных эпох с паттернами экспрессии генов и разобраться в том, как одни изменения соотносятся с другими.

Ученые проанализировали одну древнюю и одну современную популяцию. Каждая была восстановлена из пары десятков реанимированных яиц. Древняя популяция происходит из слоя, датированного (со всеми оговорками относительно точности этой оценки) 1418 годом (этот слой залегает на глубине 60-64 см). Собственно, это на сегодняшний день вообще самые древние "оживленные" животные. Современную популяцию выводили из яиц, собранных на глубине 4-8 см, - их возраст составляет 5-10 лет. Все эксперименты проводились с внучками третьего поколения от возрожденных из покоящихся яиц дафний.

Ученые смотрели на концентрацию фосфора в тканях, эффективность удержания фосфора из пищи (кормом для дафний были водоросли) и на скорость роста животных после рождения. Все эти фенотипические признаки оценивали в двух вариантах экспериментальных условий: при низкой доступности фосфора (LoP - "low phosphorus", кормовые водоросли в этом случае растили в банке с низким содержанием фосфора - таким, каким оно было в озере до начала загрязнения) и при высокой доступности фосфора (НiP - "high phosphorus", в этом случае водоросли выращивали в воде с современной концентрацией фосфора в озере). Прямые измерения позволили убедиться, что водоросли в итоге поглощают и содержат фосфор в соответствующей пропорции. Корм дафний был подобран так, что концентрации фосфора отличались в 5 раз: они получали одинаковое количество углерода (C) из расчета 3 мг/л в день, в случае LoP отношение C:P составляло 750:1, а в случае НiP - 150:1.

Саму оценку фенотипов производили по следующим параметрам:
1) Содержание фосфора в соматических тканях (bP - "body P") измеряли в тканях дафний, которые получали корм с высоким или низким содержанием фосфора на протяжении 6 месяцев (за это время успевало смениться несколько поколений дафний).
2) Эффективность удержания фосфора, потребляемого с пищей (RE - "retention efficiency"). Для измерения этого параметра сначала 20 дафний заставляли поголодать пару часов для полного опорожнения кишечника, а затем кормили водорослями, выращенными на среде с добавленным радиоизотопом фосфора 33P (в большей или меньшей концентрации). Через час дафний пересаживали в чистую воду, а через 12 часов замеряли содержание 33P в гомогенизированном препарате из них (то есть в перетертых в однородную кашицу животных). Эффективность удержания фосфора вычисляли как отношение накопленного изотопа фосфора в тканях дафний к его содержанию в единице массы водорослей.
3) Скорость роста (GR - "growth rate") - прибавка длины тела дафний с первого по пятый дни после выхода из яйца.
4) Также проводился анализ РНК. Дафний растили на среде с водорослями, богатыми или бедными фосфором, затем животных трехдневного возраста (25 штук) после небольшого голодания (для опорожнения кишечника) собирали, гомогенизировали, выделяли их РНК и анализировали на микрочипах.

Фенотипический анализ позволил установить следующее. Во-первых, у древних дафний содержание фосфора в тканях повышалось при высокой доступности фосфора и понижалось при низкой доступности фосфора, в то время как у современных содержание фосфора в тканях не зависит от содержания фосфора в пище, оставаясь постоянным. Во-вторых, удержание фосфора из пищи у древних дафний оставалось практически постоянным в любых экспериментальных условиях, а у современных оно заметно снижалось, когда дафний кормили богатой фосфором пищей. В-третьих, скорость роста, также, как и содержание фосфора в тканях, оставалась постоянной у современной популяции, но увеличивалась при более высокой доступности фосфора у древней популяции.

Обнаруженные изменения однозначно говорят о том, что за прошедший между "эпохами" срок дафнии выработали способность пластично отвечать (изменяя физиологические процессы в организме) на колебания в доступности фосфора. А пластичные реакции в метаболизме означают изменения в генных сетях, которые определенным образом отвечают на изменение условий среды.

Следующим этапом стало выявление групп генов, которые коррелируют с каким-либо из оцениваемых параметров: с различиями в каждом из фенотипических признаков, с доступностью фосфора в среде или с возрастом популяции.

Ученым удалось выделить 6 таких модулей (генных сетей) - групп генов, экспрессия которых коррелирует друг с другом и с указанным признаком в обеих или хотя бы в одной из популяций. Для обозначения модулей авторы ввели цветовую кодировку, которая использована на рисунках 3 и 4: гены, коррелирующие с признаком "удержание фосфора", изображены коричневым (BrownRE, положительно коррелирующий модуль из 815 генов) и пурпурным (Purple_RE, отрицательно коррелирующий модуль из 461 гена); гены, коррелирующие с признаком "содержание фосфора в тканях", изображены бежевым (Tan_bP, положительно коррелирующий модуль из 373 генов) и салатовым (Greenyellow_bP, отрицательно коррелирующий модуль из 439 генов); гены, коррелирующие с признаком "скорость роста", изображены светло-зеленым (Lightgreen_GR, отрицательно коррелирующий модуль из 162 генов) и синим (BlueGR, еще один отрицательно коррелирующий модуль из 1106 генов, отделенный от предыдущего, поскольку между генами этих двух модулей корреляция низкая).

Интересно, что в отличие от собственно фенотипического признака (скорость роста), экспрессия генов, попавших в два последних модуля, одинаково заметно изменялась как в популяциях и древних, и современных дафний. Авторы отмечают этот факт, но оставляют под вопросом его интерпретацию - может, будущие исследования помогут разобраться. Нужно учитывать, что здесь использовались сложные математические модели, которые обсчитывают всю сеть как единое целое (метод, на который авторы ссылаются, был предложен в 2008 году, см.: P. Langfelder, S. Нorvath, 2008. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis). Сложность модели может, увы, быть и источником некоторых не совсем ясно интерпретируемых результатов.

В каждой сети выявили несколько генов-"хабов" - центральных узлов регуляторной сети, связанных сильной корреляцией с большинством других генов в модуле или какой-то его части. Обычно подразумевается, что хабы регуляторных сетей - это гены, кодирующие белки-регуляторы транскрипции, которые специфически взаимодействуют с какими-то последовательностями ДНК и управляют работой "подчиненных" генов.

Их авторы также попытались выявить на основании своих данных по последовательностям генов дафний, результаты показаны на рис. 4. Конечно, к ним нужно относиться с определенной мерой критичности - все-таки это всего лишь биоинформатические предсказания. К тому же, некоторые гены, оказавшиеся в роли "хабов", известны, скорее, как ферменты для определенных метаболических реакций, так что они могут быть лишь косвенными индукторами активности каких-то транскрипционных факторов. Некоторые из выявленных "хабов" относятся к эпигенетическим регуляторам, например, катализируют посттрансляционные модификации гистонов, влияющие на состояние хроматина. Все остальные гены в выявленных модулях авторы также попытались соотнести с известными функциональными категориями (это тоже отражено на рис. 4).

Еще один аспект, который ученые решили проверить, - изменчивость генных сетей: в какой мере сетевые модули у дафний древней популяции (в данном случае подразумеваются вообще все модули, которые можно выявить по анализу экспрессии генов, а не только коррелирующие с изученными признаками) схожи с модулями, выявляемыми для современной популяции. Оказалось, что некоторые модули весьма устойчивы, и в них, к примеру, вошло в том числе несколько десятков генов из модулей LightgreenGR, Blue_GR и BrownPE. Но куда более любопытно то, что обнаружились и такие модули, которые не выявляются у древней популяции, однако надежно определяются у современной популяции. В такие модули вошло всего 880 генов, среди которых 36 коррелятивно связаны с признаком "удержание фосфора", 10 - с признаком "содержание фосфора в тканях" и 38 - с признаком "скорость роста".

Надо полагать, что представленные данные указывают на существенные перестройки в системе генной регуляции, произошедшие в озерной популяции дафний за срок, вероятно, менее пары сотен лет (если исходить из предположения, что данные перестройки действительно были спровоцированы фосфорным загрязнением).

В то же время представленные данные оставляют ощущение некоторой неясности - в частности, из-за сложности интерпретации результатов математических методов, использованных для сравнения структуры генных сетей и оценки корреляций. Кроме того, явно просится аналогичный анализ дафний из нескольких промежуточных временных точек, чтобы отделить те изменения, которые действительно связаны ростом содержания фосфора в среде от тех, которые могут быть связаны с какими-то другими факторами.

Хочется надеяться, что исследование будет продолжено и расширено, а дальнейшие более детальные результаты позволят прийти к более четкому пониманию механизмов, определивших выработку новых физиологических реакций у дафний.

https://elementy.ru/novosti<b>nauki/...ora_v</b>ozere
--- wfido